Presentation

Ida Nilsson, som gör sin post-doc vid Karolinska Institutet och till viss del vid Inserm U837 i Lille, söker neurobiologiska orsaker till att vissa individer drabbas så hårt av anorexia nervosa. Det är en mycket komplex sjukdom, där samverkan mellan ärftliga faktorer och faktorer i miljön leder till självsvält. Bättre kunskap om  neurobiologin kan leda till bättre behandlingsstrategier och minskad stigmatisering.

Anorexia nervosa. Ett livsfarligt tillstånd, som saknar en välfungerande behandling. Med en mortalitet på cirka 10 % är det den dödligaste av alla psykiatriska sjukdomar, och den drabbar 1,2 % av kvinnorna och 0,3 % av männen i Sverige någon gång i livet. Hur dessa individer kan motstå de hungersignaler som är så grundläggande för överlevnad är fortfarande en vetenskaplig gåta. Ida Nilsson arbetar enligt hypotesen att självsvälten hos personer som drabbats av anorexia nervosa är relaterad till en dysfunktion i födointagsreglerande nervceller. Hon ställer sig även frågan om det vid kroniska och/eller svåra fall av sjukdomen sker neurodegeneration av samma nervcellspopulation. Dessa forskningsfrågeställningar är en fortsättning av hennes doktorandprojekt där hon har studerat mekanismerna i en speciell musmodell. 
- Självklart kommer det att bli spännande att se om fynden kan återfinnas även i patienter, säger Ida Nilsson.

Den djurmodell som hon har använt sig av är den så kallade anx/anx-musen. Hos dessa djur leder en spontan, recessiv mutation till döden under levnadsvecka 3-5. Redan från födseln äter de mindre än sina friska syskon. Studier tyder på att detta beror på avvikelser i de neuronala system som styr hunger- och mättnadskänslor. Ida Nilsson förklarar hur detta system fungerar:
- Styrningen av födointag är koncentrerat till hypotalamus, och framför allt den del som kallas arkuatuskärnan. Hit kan olika hormoner ta sig in, binda till receptorer och påverka nervcellernas aktivitet. Vissa nervceller uttrycker AGRP och NPY, neuropeptider som är hungersignalerande, och vissa nervceller syntiserar POMC och CART, som signalerar mättnad. De samspelar med varandra och med andra nervceller för att på så sätt hela tiden försöka bibehålla energibalansen.

I sitt doktorandprojekt kunde hon konstatera att de sjuka mössens AGRP system utvecklades normalt fram till dag 12-15, men att de därefter fick en minskad mängd immunoreaktiva nervutskott.
- Det såg till och med ut som att de fibrer som redan hade bildats drog sig tillbaka. Vi tyckte att detta indikerade en nedbrytning av nervcellerna, och valde därför att gå vidare och titta på just neurodegenerativa tecken.
Det visade sig vara ett framkomligt spår. Ida Nilsson fann såväl aktivering av mikroglia och uttryck av immun- och apoptiska markörer som tydde på hypotalamisk degeneration. Detta är troligen ett resultat av att nervcellerna först deaktiveras, på grund av oxidativ stress och energibrist, menar Ida Nilsson. 
 - Vi hittade en dysfunktionalitet i mitokondrierna som stämde överens med mutationen i våra anx/anxmöss. Den gen som är nedreglerad i de sjuka mössen, Ndufaf1, behövs för att sätta ihop det första komplexet av proteiner i andningskedjan i mitokondrierna. Om detta inte fungerar optimalt får man extra mycket läckage av elektroner i vävnaden, och mindre ATP som bildas i cellerna. Vi har även hittat en hel del resultat i litteraturen på human komplex 1 dysfunktion som stämmer överens med våra fynd.

Som svar på den initiala ATP-bristen startar troligen en skyddsmekanism som strävar efter att minska de energikrävande nervcellernas aktivitet. Men vid långvarig deaktivering blir det tänkta skyddet istället till stor skada.
- Min slutsats i avhandlingen var att kroniskt minskad neuronal aktivitet leder till minskat uttryck av gener som stödjer neuronal överlevnad, vilket möjliggör neurodegeneration, säger Ida Nilsson.  

Och nu ska hon alltså gå vidare och försöka utröna huruvida den här processen även är involverad i självsvältprocessen vid anorexia nervosa hos patienter. Hon har fått klartecken för att starta de första studierna, där två olika metabola MRI-tekniker (diffusionsMRI och proton MR spectroscopy) tillsammans ska användas för att spegla aktiviteten i arkuatuskärnan.

- Jag ska undersöka patienter som har fått sin diagnos  för minst ett år sedan, och som lider av den då kallad restriktiv typ av anorexia nervosa. Det är personer som äter extremt lite, och det är framförallt hos dessa som jag misstänker att neurobiologiska orsaker kan förklara en ökad känslighet för de faktorer i omgivningen som kan starta sjukdomsförloppet. 

Redan år 1911 uttalade Bleuler att ”det allvarligaste av alla schizofrena symtom är suiciddriften”. Trots detta är det fortfarande mycket som är oklart kring vilka faktorer som ökar risken för självmord vid schizofreni.
– Randomiserade kliniska prövningar är svåra att genomföra, både av etiska och ekonomiska skäl. Fullbordade suicid är trots allt en sällsynt händelse, och man kan inte randomisera till olika behandlingar, säger Johan Reutfors som trots detta valt att närmare undersöka, och försöka identifiera, riskfaktorerna för suicid vid schizofreni.

Tack vare Sveriges personnummer och register har han lyckats göra en stor populationsbaserad fall/kontroll studie, ovanlig i sitt slag. 
– Vi har identifierat alla cirka 4000 patienter i Stockholms län som för första gången fick diagnos schizofreni eller schizoaffektiv sjukdom vid utskrivning från en psykiatrisk klinik mellan juni 1984 och december 2000, berättar Johan Reutfors.
Man fann 100 patienter under 65 år som hade begått självmord inom fem år från diagnosen. Journaler kunde återfinnas för 84 av dessa, en förutsättning för att inkluderas, eftersom journaldata tillsammans med registeruppgifter är grunden för analyserna.
De 84 suicidfallen kompletterades med lika många kontroller, matchade för ålder och år för diagnos. Under datainsamlingen kände Johan inte till om uppgifterna härrörde från ett suicidfall eller en matchad kontroll, en form av blindning som är en av styrkorna med studien.

Johan Reutfors fann att högre utbildning (i detta fall över grundskolenivå) förhöjde suicidrisken cirka tre gånger. En symtomdebut som infaller över 30 års ålder samt tidigare suicidförsök ökade risken fem gånger. Att vara född i Sverige var också kopplat till en högre risk, vilket är förvånande, och tvärtemot vad som gäller generellt i befolkningen.
– I vår studie kunde vi inte se att manligt kön var någon signifikant riskfaktor, inte heller missbruk eller ärftlighet för psykisk sjukdom eller suicid, eller tvångsvård. Det verkar alltså som att vissa riskfaktorer skiljer sig åt jämfört med de som är identifierade i allmänna befolkningen.

Det fanns också skillnader i sättet att ta sitt eget liv. Vid schizofreni väljer signifikant fler människor en våldsam metod, som hopp från hög höjd eller framför fordon. Färre väljer förgiftning eller överdos, vilket indikerar att det inte är så effektivt att försöka förhindra tillgång till läkemedel.
En annan intressant iakttagelse är att personer som har affektiv sjukdom, det vill säga uppfyllde DSM-IV-kriterier för depression eller bipolär sjukdom, hade en tre gånger förhöjd suicidrisk. Detta avslöjade Johan Reutfors genomgång av den diagnostiska profilen genom ett så kallet OPCRIT-system, där psykiatriska symtom skattas via 90 stycken items.
- Vi vet inte om dessa patienter har vandrat över till en annan sjukdomsbild, eller om de fått fel diagnos från början. Men förnyade diagnostiska bedömningar är värdefulla också för suicidriskbedömningen.

En annan delstudie har tittat på hur suicidrisken förhåller sig till farmakologisk behandling och läkemedelsbiverkningar. Han såg en lägre suicidrisk bland de patienter som fått andra generationens antipsykotiska, men ingen signifikant påverkan på suicidrisken av antidepressiv medicinering.
När det gäller biverkningarna återfann Johan Reutfors inte den lägre risk vid akatisi som tidigare fallstudier har föreslagit. Däremot fanns en lägre risk för självmord bland patienter med extrapyramidala biverkningar förutom akatisi, vilket kan tänkas bero på högre compliance och/eller högre doser av antipsykotiska läkemedel.

Johan Reutfors forskning har således renderat i nya spännande rön, men det finns fortfarande mängder av data insamlade för att analysera vidare. 
– Tack vare det här stipendiet så kan vi gå vidare och se på hur våldsamt och aggressivt beteende hänger samman med suicid, liksom betydelsen av vanföreställningar och hallucinationer. Vi har även rättstoxikologiska data på de suiciderade patienterna, vilket ger oss möjlighet att jämföra de läkemedels som föreskrivits, med de substanser som fanns i kroppen vid obduktion.

En stor del av den kända patologin vid Alzheimers sjukdom består av aggregerade proteiner, senila plack av Aβ och neurofibrillära nystan av fosforylerat tau. Normalt sett ska strukturer som spårar ur tas om hand av nervcellernas nedbrytningssystem. Kan en dysfunktion i dessa processer göra att upprensningen inte sker som det ska? Nya rön tyder också på att försämrad axonal transport uppkommer ganska tidigt i sjukdomsprocessen. Lotta Agholme kopplar samman dessa båda tankar i sin forskning. 

Syftet med forskningsprojektet som resulterade i Svenska Lundbeckstiftelsens stipendium är att undersöka hur inhibering av proteasomen påverkar fosforylering av tau, och hur detta i sin tur påverkar stabiliteten hos mikrotubili samt den axonala transporten. 
Men Lotta Agholme har också under sin doktorandtid studerat hur nervceller kan ”smitta” varandra med Aβ. Man vet att Alzheimers sjukdom, från att starta i hippocampus Entorhinal Cortex, sprider sig vidare i hjärnan enligt ett speciellt mönster. Lotta Agholmes grupp har utvecklat en användbar cellulär modell, genom att odla humana celler i en 3-dimensionell gel och differentiera dem till neuronlik morfologi och funktion. I denna modell har de tydligt kunnat visa att Aβ transporteras mellan celler, men bara om de har kontakt med varandra.
– Om det av någon anledning finns för mycket Aβ i nervcellen, och det normala sättet att göra sig av med detta inte fungerar, så verkar det som att cellerna försöker att skicka detta Aβ vidare. Detta skulle kunna vara en förklaringsmodell till spridningen.

Frågan kvarstår dock – varför uppkommer från början överskottet av Aβ? Och varför kan inte kroppens sinnrika system undvika att de stora aggregat av Aβ plack och neurofibrillära tau-nystan, som kännetecknar Alzheimers sjukdom bildas?
Cellen har två sätt att bryta ner uttjänta eller felveckade proteiner, det lysosoma autofagisystemet samt det proteasomala. Man vet sedan tidigare att både lysosom- och proteasomfunktionerna blir nedsatta vid åldrande, och detta är än mer uttalat vid Alzheimers sjukdom.
Lotta Agholme har i ett tidigare projekt visat hämning av proteasomerna leder till celldöd. I ett annat projekt har hon tittat närmare på hur proteasomaktiviteten påverkar transporten i nervcellerna. Man tror att en störning i axonal transporten och/eller överföring av neurotransmittorer är något som uppkommer tidigt i sjukdomsprocessen.
– Vi såg tydligt att vesiklarna ligger mer stilla då vi hämmar proteasomen, och att transporten av andra organeller i utskotten försämras. Och då ligger förstås frågan nära till hands - Varför får man försämrad transport? En naturlig tanke är att tau är involverat. Normalt sitter tau på mikrotubili, alltså den ”järnvägsräls” som nervcellerna använder för att transportera sitt gods. Men när tau förändras genom så kallad fosforylering släpper det från mikrotubili och aggregerar. Det leder till att mikrotubili inte blir så stabilt längre, och man tror också att det kan leda till att transportproteinerna kickar av sin last för tidigt, så att den inte når synapserna.

Om teorin stämmer blir det logiskt att i nästa steg fundera på orsaken till den ökade fosforyleringen av tau, och hur man kan förhindra detta. Proteasomens försämrade funktion kan leda till att fosfatpåsättande proteinerna uppregleras. Lotta Agholme har nu mycket riktigt gått vidare och undersökt vad som händer då man hämmar proteinerna JNK/c-Jun och ERK 1 / 2, som båda är delaktiga i att sätta på oönskade fosfatgrupper på tau-proteinet. Resultaten är spännande så här långt.
– Preliminära data visar att man kan få en tidigare hämmad transport att återgå till det normala genom att hämma dessa proteiner, och på så sätt minska fosforyleringsgraden av tau.

Lotta Agholme ser nu framemot att stipendiet ska ge henne möjlighet att närmare studera hur fosforyleringen ändras, och vilka mekanismer som kan koppla samman fosforyleringen hos tau med de förändringar som ses i transporten längs axonen. Om hon lyckas hitta denna koppling banar det väg för en annan typ av interventionsforskning, som i framtiden kan leda till möjligheter att bromsa processen tidigt med helt nya behandlingsstrategier.

Vid Alzheimers sjukdom förekommer fler förändringar än klassiska plack och neurofibrillära nystan. Bland annat ses mitokondriedysfunktion, som till exempel färre mitokondrier i påverkade neuron och minskad enzymaktivitet i citronsyracykeln och elektrontranssportkedjan.  Andra fynd är ökad kolesterolhalt i serum, förändrad fettsyra- glukos och fosfolipidmetabolism samt onormal kalciumhomeostas.
– Allt det här kan sammanfattas som någon typ av metabolisk störning. Och tittar man närmare på de olika processerna så kan man konstatera att mycket av det här regleras just i MAM, säger Louise Hedskog.

Mycket kring MAM är fortfarande okänt, och regionen är relativt lite utforskad. Men man vet att den är viktig för såväl fosfolipid- som kolesterol- och sfingolipidmetabolism. Enzymer på MAM-sidan och i mitokondrien deltar vid olika steg i syntesen, och intermediärmetaboliterna vandrar mellan de båda sidorna.
- Med andra ord, om mitokondrien och MAM inte har kontakt med varandra så kommer inte synteserna att kunna ske, säger Louise Hedskog och berättar mer om vad som händer i MAM:
- Regionen spelar stor roll för reglering av kalcium. Här finns proteiner som binder och lagrar kalcium, och det behövs också kalcium för att aktivera enzymer i mitokondrien, bland annat i citronsyracykeln för att bilda ATP.  Om det blir för mycket kalcium i mitokondrien blir det däremot toxiskt, och kan istället leda till apoptos. I MAM finns viktiga proteiner, som till exempel sigma‑1 receptorn, som man tror reglerar kalciumkanaler och styr hur mycket som förs över till mitokondrien. Ett annat viktigt protein på MAM-sidan är PACS2, som är involverat i signaleringen av apoptos.

Det finns fler intressanta kopplingar mellan MAM och Alzheimers sjukdom. Nyligen har man visat att både APP och γ-sekretas finns anrikade i regionen, vilket tyder på att Aβ skulle kunna bildas här. Dessutom har PS2 mutationer, mutation som medför familjär typ av Alzheimers sjukdom som debuterar redan vid 45-50 årsåldern, visats kunna leda till närmare kontakter mellan mitokondrien och MAM.  

Att så mycket regleringsmekanismer som kan kopplas till patologin vid Alzheimer sjukdom sker i en och samma region gjorde att Louise Hedskog och hennes forskningskollegor valt att undersöka den närmare. Dessutom har ingen tidigare studerat MAM i neuron, så här fanns det ett helt outforskat område att ta sig an.  Det gjorde Louise Hedskog dels genom att studera human hjärnvävnad och dels använda sig av olika musmodeller.

Genom att odla primärkulturer av hippocampusneuron kunde hon konstatera att MAM finns uttryckt inte bara inne i cellkroppen, utan även långt ute i distala delar av neuriterna.
- Det tyder på att de har en väldigt viktig roll, och för att undersöka detta ännu mer i detalj har vi isolerat synaptosomer, renat fram presynapsen och postsynapsen och studerat med  elektronmikroskopi. Slutsatsen av dessa försök är att hon tror att MAM finns uttryckt i själva synapserna, eller åtminstone väldigt nära dessa.

Louise Hedskog har även visat hur viktig MAM-regionen är för neuronernas överlevnad genom att slå ut de båda MAM-proteinerna PACS2 och sigma‑1 receptorn genom siRNA-teknik. Resultaten visar att neuriterna då börjar degenerera.

Louise Hedskog har också använt en transgen musmodell som har två mutationer i APP-genen, och som utvecklar Alzheimerlik patologi vid ungefär 6 månaders ålder. Deras hjärnor undersöktes vid 2 månader, 6 månader och 10 månader, för att se om MAM-regionens proteiner påverkats.
- Vad vi generellt kan se är att uttrycket av de här MAM-proteinerna ökar, för vissa av dem redan vid 2 månaders ålder. Det tyder på att det händer något i den här regionen innan plack har bildats. Mekanismen är fortfarande oklar, men oavsett förklaringsmodell är det intressant att den här regionen är påverkad långt innan man ser en patologisk förändring.

Louise Hedskog kunde även se att något händer i MAM-regionen i human hjärnvävnad från avlidna Alzheimer patienter. Här var två av de tre MAM-proteinerna man analyserat uppreglerade, medan det tredje istället var nedreglerat. Det är dock svårt att veta hur det faktum att man studerat vävnaden post-mortem påverkar resultaten.

Forskningen går vidare, för att försöka binda samman det som händer i MAM-regionen och de patologiska processer som sker vid Alzheimers sjukdom.

Louise Hedskog hoppas att stipendiet kan bidra till ytterligare kunskap om MAM i neuron och synapser, vilket skulle kunna få stor betydelse för utveckling av nya läkemedel.
 - Vi vill studera den här kontakten och interaktionen mellan MAM och mitokondrien ännu lite närmare. Vi har gjort försök som visar att om man behandlar cellerna med Aβ så ökar kontakterna mellan MAM och mitokondrien, men vi är fortfarande osäkra på vad det betyder. Det kan vara en positiv mekanism som cellerna tar till för att skydda sig själv; att de uppreglerar kontakterna, men det kan också vara en del av en patologisk process.
Hon håller i detta sammanhang också på att titta närmare på huruvida en agonist till sigma‑1 receptorn i MAM kan påverka kontakterna, och därmed överlevnaden av hippocampusneuronen, på något sätt.

Titeln påThomas Näsströms aktuella forskningsprojekt är ”Behandling av α-synukleinaggregering på cellkultur med oligomerspecifika antikroppar”. Han har redan passerat viktiga forskningssteg på vägen, eftersom studierna av såväl instabila som ”osynliga” molekyler medför speciella utmaningar.
Alpha-synuklein är ett protein där man i dagsläget vet mer om dess skada än nytta i kroppen. Fortfarande är den biologiska funktionen till stora delar oklar, men proteinet finns i presynaptiska nervterminaler, och antas ha betydelse vid nervsignaleringen. Vad man däremot vet är att den i sin aggregerade form är inblandad vidneurodegeneration.

Thomas Näsström har särskilt intresserat sig för relevansen vid Parkinsons sjukdom, där så kallade Lewykroppar bland annat har påvisats i substantia nigra. Lewykroppar beskrevs redan i början av 1900-talet, men det dröjde till 1997 innan man kunde visa att dessa i huvudsak består av aggregerat α-synuklein. Thomas Näsströms forskning är en del i kampen för att försöka stoppa dess skadliga verkan. Han har riktat in sig på de toxiska intermediära formerna, så kallade oligomerer eller protofibriller.
– Problemet med dessa molekyler är att de är väldigt instabila, och därför svåra att studera, säger han.
Det har Thomas och hans forskningsgrupp löst genom att stabilisera proteinerna genom modifiering med aldehyder, samma aldehyder som bildas som biprodukter vid lipidperoxidation, då fria radikaler attackerar cellmembranen i kroppen. Denna typ av modifierat material har man även funnit i vävnad från Parkinsonsjuka hjärnor, vilket gör det extra intressant att studera.
–Vi lyckades stabilisera förloppet, och vi kunde också konstatera att dessa α-synukleinoligomerer var väldigt potenta då det gällde att orsaka celldöd i cellkulturer. Därmed kunde vi också gå vidare i försöken att ta fram antikroppar mot dessa skadliga former, berättar Thomas.

För att kunna detektera och studera hur proteinerna uppför sig måste man dock använda sig av någon typ av reportergen. Ett särskilt system för att mäta oligomerer i cellkultur har utvecklats inom ramen för ett samarbete med Universitetet i Lissabon. Här används GFP, Green Fluorescent Protein, som reportergen. Thomas Näsström åkte således till Portugal för att göra sina avancerade cellförsök:
- Vi kopplade på en del av GFP på en α-synukleinmolekyl, och den andra delen av GFP på en annan α-synukleinmolekyl, och transfekterade dem in i cellerna. Där det sedan lyser grönt i cellerna vet vi att α-synuklein har bundit till sig själv. På detta sätt kan vi i realtid studera hur α-synuklein aggregerar.

Därmed kunde Thomas också studera förloppet då man tillsätter olika antikroppar, för att se om de lyckades inhibera aggregeringen. Han använde sig av olika mätmetoder, som till exempel fluorescensmikroskopi, med gott resultat.
– Cellerna som behandlades med antikropparna hade lägre fluorescens och därmed mindre aggregering, och vi kunde också slå fast att antikropparna verkligen tog sig in i cellerna genom cellmembranet. Med hjälp av ELISA kunde vi även se att nivåerna av α-synuklein var lägre i de celler som var behandlade med antikroppar. Det verkar alltså ske någon form av ökad nedbrytning, men detta måste vi studera mer i detalj.

Thomas Näsström har således kommit så långt att han nu vet att han både kan stabilisera och detektera aggregeringsförloppet. Han har också kunnat visa att antikroppar mot α-synuklein och dess oligomerformer verkar inhibera aggregeringen. Symposiet kommer mycket lägligt eftersom en spännande fortsättning väntar, både i Uppsala och inom internationella forskargrupper med mångårig erfarenhet inom området.  
– Det vi håller på med just nu är att undersöka hur antikropparna beter sig vid behandling på en musmodell för sjukdomen. Vi har sett goda preliminära resultat, men den första studien är fortfarande under utvärdering. Vi har också förhoppningar om att denna typ av antikroppar kan fungera som ett effektivt diagnostiskt verktyg för alla de åkommor som involverar Lewykroppar.